奥氏企业（英语：Oscorp）的科学家理查德·派克（英语：Richard and Mary Parker）在公司删除所有关于蜘蛛基因工程的档案，回家后录下一段自录像以解释原因，随后发现他的工作室遭到爆窃。理查德和妻子玛莉把儿子彼得·派克寄放在哥哥班·派克和其妻子梅的家中，随后搭乘私人飞机逃亡。在上传自录像等实验笔记至一座服务器时，飞机的副驾驶突然劫持飞机意图阻止他，但理查德还是成功将资料上传出去，而飞机随后失控坠毁导致夫妻俩葬身火海。
现今长大成人的彼得成为纽约市英雄“蜘蛛侠”，前去参加高中毕业典礼的路上，帮忙逮捕开卡车横冲直撞的俄国强盗阿列克希·西赛维奇，并在路边救下奥氏企业的电机工程师马克斯·狄伦。毕业后，彼得和女友格温·斯黛西庆祝毕业时，基于对格温已故的父亲乔治（英语：George Stacy）发誓过的承诺，开始对他和格温刚复合的感情捉摸不定，格温因此正式跟彼得分手。与此同时，奥氏企业总裁诺曼·奥斯本因绝症逝世，他将公司所有的事务存于一个工具盒，交付给继承总裁位置的儿子兼彼得的儿时玩伴哈利·奥斯本。哈利从父亲临终前的话里得知自己也遗传到家族绝症，且首个病征正是出现在哈利这个岁数。
在工作和生活上处处遭人无视的马克斯开始迷上营救过他的蜘蛛侠，而在生日当晚被上司（英语：Alistair Smythe）强行留下来修复电机，却不慎误触高压电线而掉进电鳗供电池中，遭遇强大电击而沦为一具焦尸。奥氏企业副总裁唐诺·曼肯（英语：Donald Menken）为了防止这宗意外损害到公司名声，命令手下封锁有关马克斯的一切资讯。然而，马克斯的焦尸因产生某种变异而于停尸间复活，变成一个蓝色皮肤、血管通电的异能者。他来到时代广场时因虚弱而开始汲取地下的电力，被警察发现后在街上造成大混乱。彼得迅速换装来到现场而打算与他和平谈判，但随着市民们集体为蜘蛛侠欢呼，让马克斯意识到自己对蜘蛛侠而言无足轻重，一怒之下大肆破坏广场。彼得利用消防队的高压水将其制伏，马克斯被警察收押并关入收容异能者的雷文克劳夫精神病院（英语：Ravencroft），并遭受卡夫卡医生（英语：Ashley Kafka）的无情对待与实验。
哈利努力查找资料企图摆脱死亡厄运，断言与蜘蛛基因成功结合的蜘蛛侠之血液足以开发出他的救命解药，在得知彼得为《号角日报》拍摄蜘蛛侠的照片后希望能商量一番。彼得表面上答应哈利，但后来还是扮成蜘蛛侠忍痛回绝他，仅因不想重演柯特·康纳斯的悲剧。深感绝望的哈利后来被曼肯陷害而被革职，但他受秘书费莉西亚的提议而受启发，前往雷文克劳夫精神病院释放马克斯并与他达成共识。受马克斯的协助之下，哈利回到公司杀死保全队长，持枪挟持曼肯进入企业底层的最高机密储藏室，内部放置著多架先进武器，其中包括一架背包式的四条机械手以及一副钢铁翅膀。哈利注射某种黑色蜘蛛毒液后虽然治好病症，却因为副作用而开始变异成类似“恶魔”的生物。曼肯趁机逃跑后，痛苦万分的哈利紧急换上一件战甲与配对的滑翔翼，使用战甲的自愈功能才暂时稳定身体痛苦。
彼得得知格温考上牛津大学而即将搬去英国，陷入低潮之下无意间发现父亲理查遗留的一座废弃地铁站罗斯福（Roosevelt）的地点。通过车站隐藏的秘密实验室中的电脑，彼得从父亲死前上传的自录像中发现，理查当年拒绝为诺曼开发基因武器而受他陷害，才被迫丢下儿子逃亡，认为自己只要离世，研究就不会继续下去。彼得瞬间领略到父亲所受的冤屈后，同时结束心中多年的困扰。在格温即将离开纽约之际，彼得在布鲁克林大桥上用蜘蛛丝写字表达对她的爱。彼得将格温接到大桥顶端相拥，正式告别过去且决定跟随格温去英国。
马克斯瘫痪奥氏电力公司的发电厂造成全市停电，打算证明现在的自己已立于顶点，独自着装前去的彼得来到发电厂与马克斯决战。正当彼得被电流困住时，及时来帮忙的格温协助修好电源，使身上缠绕电线的马克斯以过电流的形式被当场炸碎而亡。但麻烦刚结束，陷入丧心病狂的哈利搭乘滑翔翼飞到他们面前，看到格温在场后意识到彼得就是蜘蛛侠，为了报复彼得弃自己不顾，挟持格温至钟塔顶楼。彼得虽然击败哈利，却没来得及救下直坠地面的格温，使她掉下去而不幸丧生[备注 1]，无助的彼得只能抱着死去挚爱而泪声俱下。格温的葬礼结束后，彼得责怪自己违背对乔治的承诺，生无可恋之下就此放弃蜘蛛侠的身份。
五个月后，神秘老人葛斯塔夫·费尔斯（英语：Gentleman (character)）去探望关在雷文克劳夫精神病院的哈利，问清楚储藏室的其他内幕后，认为没有蜘蛛侠可以顺利进行下一步。费尔斯释出先前被彼得逮捕的阿列克希，并提供他一套犀牛人铠甲。阿列克希在纽约街头大肆破坏，彼得却在家无动于衷。当他收看之前错过的格温的毕业典礼演讲，听见她在演讲中提醒所有人永远不要放弃希望后，彼得重获自信而穿上蜘蛛侠战服回到街道上，毫无畏惧地对抗直冲过来的阿列克希，并找到值得他去战斗的事物[备注 2]。